精品一区二区中文字幕在线观看,国产av天堂亚洲av麻豆,麻豆av传媒在线观看

技術文章ARTICLE

您當前的位置：首頁 > 技術文章 > 細胞凍存的具體步驟是什么?

細胞凍存的具體步驟是什么?

發(fā)布時間： 2025-12-30　　點擊次數： 371次

細胞凍存是細胞生物學領域長期保存細胞活性的核心技術，通過梯度降溫結合凍存液保護，使細胞代謝停滯，實現長期穩(wěn)定保存。其核心原則是“慢凍快融”，凍存步驟需嚴格遵循標準化流程，避免細胞損傷，以下是詳細的實操步驟及關鍵要點：

一、凍存前準備（核心物料與環(huán)境）

細胞準備：選擇對數生長期、活性≥90%的細胞，確保細胞狀態(tài)良好（避免老化、污染細胞）；提前24h更換新鮮培養(yǎng)基，保證細胞活力。

凍存液配制：

常規(guī)細胞凍存液：胎牛血清（FBS）：培養(yǎng)基：二甲基亞砜（DMSO）=7:2:1，DMSO是核心保護劑，可穿透細胞膜，降低冰點，避免細胞內形成冰晶損傷細胞。

無血清凍存液：商用無血清細胞凍存液（含保護劑），無需自行配制，適配干細胞、敏感細胞，避免血清批次差異影響。

注意：凍存液需現配現用，DMSO常溫下對細胞有毒，需在冰浴中配制，全程低溫操作。

器材準備：無菌離心管、凍存管（標注細胞名稱、凍存日期、代次）、移液槍、無菌吸管、離心機、冰浴盆、程序降溫盒（含異丙醇）、-80℃冰箱、液氮罐。

環(huán)境準備：超凈工作臺紫外消毒30min，無菌操作，避免污染。

二、核心凍存步驟（標準化操作）

步驟1：細胞消化與收集

吸棄培養(yǎng)瓶/皿中的舊培養(yǎng)基，用無菌PBS緩沖液輕輕漂洗細胞2次，去除殘留血清和胰酶抑制物。

加入適量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（覆蓋細胞表面即可），37℃培養(yǎng)箱孵育1-3min，顯微鏡下觀察細胞變圓、間隙增大，立即加入2倍體積的含血清培養(yǎng)基終止消化。

用無菌吸管輕輕吹打瓶壁，使細胞完全脫落，形成單細胞懸液，轉移至無菌離心管中。

步驟2：細胞離心與計數

離心管平衡后，放入離心機，800-1000rpm離心5min（低速離心避免細胞損傷）。

離心結束后，緩慢吸棄上清液，避免擾動細胞沉淀；用少量新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，取少量細胞懸液進行臺盼藍染色計數，確保細胞活性≥90%。

步驟3：細胞重懸與分裝

向細胞沉淀中加入預冷的凍存液，輕輕吹打均勻，調整細胞濃度為1×10?-1×10?個/mL（濃度過高易導致細胞損傷，過低復蘇效率低）。

將細胞懸液分裝至無菌凍存管中，每管1-1.5mL，避免管內產生氣泡；擰緊凍存管蓋，再次核對標注信息。

步驟4：梯度降溫（關鍵步驟，避免冰晶損傷）

梯度降溫是細胞凍存的核心，目的是讓細胞緩慢脫水，減少冰晶形成，目前主流兩種方法：

程序降溫盒法（常用）：

將凍存管放入含異丙醇的程序降溫盒中，程序降溫盒可實現-1℃/min的勻速降溫。

放入-80℃冰箱，靜置12-24h，確保細胞完全凍存。

手動梯度降溫（無程序降溫盒時）：

凍存管先置于4℃冰箱30min，再轉移至-20℃冰箱1h，接著放入-80℃冰箱過夜，步驟不可省略，避免降溫過快損傷細胞。

步驟5：液氮長期保存

從-80℃冰箱取出凍存管，快速轉移至液氮罐的氣相層（溫度-196℃），避免常溫暴露時間過長（≤1min）。

記錄凍存管在液氮罐中的存放位置，建立凍存臺賬，方便后續(xù)查找。

三、不同類型細胞的凍存注意事項

貼壁細胞：消化時間需精準控制，避免過度消化導致細胞膜損傷；吹打時動作輕柔，減少細胞機械損傷。

懸浮細胞：離心前可適當提高離心轉速（1000-1200rpm），確保細胞沉淀完全；凍存時可適當提高細胞濃度（1×10?個/mL）。

干細胞/敏感細胞：選用無血清凍存液，或在凍存液中添加額外保護劑（如海藻糖）；降溫速率可調整為-0.5℃/min，進一步減少損傷。

原代細胞：凍存前需確保細胞純度，避免雜細胞影響；凍存液中血清比例可提高至80%，增強保護效果。

四、凍存后質量驗證（可選）

凍存1-2周后，隨機取出1-2支凍存管復蘇，檢測細胞活性和生長狀態(tài)：

快速37℃水浴解凍，臺盼藍染色計數，活性≥80%為合格。

接種后觀察細胞貼壁/生長情況，確保細胞形態(tài)和功能正常，凍存效果達標。

五、常見問題與解決方案

細胞復蘇后活性低：

原因：降溫過快、凍存液配比錯誤、細胞狀態(tài)差。

解決：嚴格遵循梯度降溫，現配凍存液，選擇對數生長期細胞。

凍存管爆炸：

原因：凍存管密封不嚴，液氮滲入，解凍時受熱膨脹。

解決：擰緊凍存管蓋，解凍前檢查凍存管是否破損，解凍時開蓋前在超凈工作臺中靜置1min。

細胞污染：

原因：操作環(huán)境不無菌、凍存液/器材污染。

解決：超凈工作臺嚴格消毒，使用無菌器材，凍存液過濾除菌。

下一篇：挪威Sero質控品的種類可分為哪幾種？

上一篇：Alpaqua磁力板的特點體現在哪些方面？

產品中心 Products

精品视频人妻少妇一区二区三,一区二区三区四区五区国产91,国产熟女精品自拍视频,大片在线观看免费视频国产,男人鸡鸡插女人逼,97大神在线观看,日本熟妇免费一区,国产91原创在线一区导航,九色porny视频在线

細胞凍存的具體步驟是什么?